多肽溶解中的主要問題是二級結構的形成。

雖然疏水肽鏈二級結構的形成更明顯，但除了最短的肽鏈外，該現象發生在幾乎所有肽鏈，與極性無關。因此，溶解多肽的第一個原則是用無菌的蒸餾水或去離子水（如果條件允許則用無氧水）。

多肽溶液可能遇到細菌降解。為避免該現象的發生，多肽應溶解在無菌的蒸餾水中，或者用0.45或0.2μm孔徑的濾膜過濾除菌。

包含Cys、Met、Trp的多肽特別容易氧化，因此應該溶于無氧的水中。無氧水可以通過注入惰性氣體（氮、氦、氬）減壓除氣得到。

若多肽不溶于純水，超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度。注意：超聲處理會引起溶液發熱和多肽降解。

若多肽中包含多個堿性氨基酸，使用1~10%的乙酸水溶液；對于疏水性非常強的多肽，則使用50%乙酸。

若多肽中含有大量酸性氨基酸，可用1~10%氨溶液或乙酸乙基或重碳酸鹽等揮發性的堿性緩沖液溶解。pH值在層析前必須調整。

異丙醇和乙腈能溶解中等大小的肽。若肽要上柱，有機溶劑的量則必須很少，否則將嚴重影響滯留時間。

若多肽因為含有Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala等芳烴側鏈而高度疏水，或為中性肽時，DMF或DMSO等膜變性劑的使用，有助于多肽的溶解。